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要(yao)用(yong)顯(xian)微鏡(jing)在高倍鏡(jing)下檢查標(biao)本，有(you)許多因素需要(yao)考慮。其中包括分辨率(lv)、數值孔徑（NA）、物鏡(jing)的工作距離(li)以及物鏡(jing)前透鏡(jing)采集圖像所(suo)用介質的折射率。在(zai)這篇文章中，我(wo)們將(jiang)簡要地看(kan)一(yi)下如何在蓋玻片和物鏡(jing)前透鏡(jing)之(zhi)間利用(yong)浸(jin)泡介質幫助提高NA和分辨(bian)率(lv)。此外，我們(men)還(huan)將考慮空氣和(he)構成(cheng)載玻(bo)片(pian)、蓋玻(bo)片(pian)的(de)玻璃的折射率，以(yi)及當光從(cong)一種介(jie)質傳播到另一種介(jie)質時，如何使用浸沒介質部分地(di)減少錯配(pei)。此外，文(wen)中還提(ti)供了使用油浸(jin)式(shi)物(wu)鏡(jing)的(de)實用技巧以及水浸(jin)式(shi)物(wu)鏡(jing)的(de)優勢，特別是針對活細胞的成像。
光學顯微(wei)鏡所面臨的主要問題之一是克服某些光學分辨率的限制并提高系統的NA值。簡言之，物鏡的NA是指從標本中收集光的能力，而分辨率是指物鏡分辨標本中細節的能力。
分辨率和NA將在其他文章中詳細說明，我們現在將介紹顯微鏡專家可用的浸沒技術，這種技術可(ke)在高倍放大率下對標本進行成像(xiang)，同(tong)時克服分辨率的一(yi)些限(xian)制。
在物鏡前透鏡和標本蓋玻片之間的空隙中填充浸沒液體可提高物鏡的分辨率。當光從一種介質傳遞到另一種介質（例如，通過玻璃到空氣）時會發生折射 - 換句話說，光會彎曲并散射。任何折射到空氣中的光線、被蓋玻片反射的光線或被物鏡前透鏡的金屬外殼實際阻擋的光線都不會對成像產生貢獻。浸沒液(ye)體的目的在于減少光在標本上形(xing)成(cheng)的折射和(he)反射，并提(ti)升物(wu)鏡捕捉這些(xie)偏離光的能力(li)（見圖1）。
圖1
光線穿(chuan)過的(de)介質的(de)物理性質決(jue)定了光線被折射的(de)程度。“折射率"是一(yi)個數值(zhi)（沒有單位），該數值(zhi)決(jue)定了光通過材料時的(de)折射程度。空氣的(de)折射率為1.0，而(er)顯微鏡載玻片和蓋(gai)玻(bo)片的折射率通常為1.5。考慮到(dao)這一差異(yi)，浸(jin)泡液體的(de)目(mu)的(de)是匹配（盡可能接近）玻片的(de)折射率，從(cong)而增加形成最終圖像的(de)光線量。隨后，大多數浸油(you)的折射率為1.51。常(chang)見折射率見表1。
浸沒介質 | RI |
空氣 | 1.00 |
水 | 1.33 |
甘油（100%） | 1.47 |
香柏油 | 1.51 |
徠卡浸(jin)沒油（標準和“F"型） | 1.51 |
玻片 | RI |
玻片（硼硅酸鹽或“Parex"） | 1.47 |
玻(bo)片（冕玻(bo)璃(li)或鈉(na)鈣(gai)硅玻(bo)璃(li)） | 1.51 |
封片介質 | RI |
細胞培養基 | 1.31至1.33 |
Fluoromount-G™ | 1.4 |
ProLong®/ProLong® Gold | 1.46 |
VECTASHIELD® | 1.44 |
VECTASHIELD® Hard+Set™ | 1.46 |
Mowiol® | 1.41 – 1.49 |
理想情形是創建所謂的“均質浸沒系(xi)統(tong)"。使用該系統可以獲得最大的分辨率和NA。均質浸沒系統的目的是匹配（盡可能接近）物鏡前透鏡、浸沒介質、蓋玻片/載玻片、封片劑和（原則上）聚光鏡透鏡的折射率和NA（見圖2和表1）。
通常不需要在聚光鏡的透鏡上使用浸沒液體。如果顯微鏡的(de)設置和校(xiao)準正確，且在整個樣本上獲得最佳對比度和照明度（見“關于科勒照明"的文章），則聚光鏡將處于最適宜的位置和設置，從而有助于顯(xian)微鏡系統的整體NA。
圖2：標本和物鏡前透鏡之間所有光學元件的折射率會給圖像質量帶來很大影響。理想情況下，它們應盡可能緊密地相互匹配，如本例中的標本使用甘油基封片劑。
顯微鏡物鏡需要考慮的另一個因素是“工作距離(li)"。這是當樣本處于銳聚焦時，物鏡前透鏡和蓋玻片表面之間的實際距離（見圖3）。當物鏡移到離載玻片更近的位置時，焦平面進一步移向樣本中。然而，這在物理上受到限制，因為物鏡只有在接觸到蓋玻片后才能移動。工作距離與每個物鏡的放大倍數成反比關系。例如，10倍物鏡的工作距離可能為4 mm，而100倍油浸物鏡的工作距離通常為0.13 mm。相比之下，一些水浸/水澆蘸（Water Dipping）物鏡的工作距離約為3 mm。工作距(ju)離是另(ling)一條信息，通常刻在物鏡筒上(shang)，縮寫為“WD"（不要與水鏡混淆-見下文）。
圖3
使用油浸物鏡時要記住的一個關鍵因素是使用正確匹配的浸油。只能使用(yong)物鏡制造商(shang)推(tui)薦的(de)油(you)。多年來，杉(shan)木油(you)是常用(yong)于浸(jin)沒(mei)介質(zhi)（目前仍在市(shi)場上出售）。雖然這(zhe)種油(you)的(de)折射率為(wei)1.516，但(dan)存在硬化趨勢，如(ru)果使用(yong)后(hou)不(bu)取出，可能會損壞(huai)透鏡。此(ci)外，這(zhe)種油(you)會吸(xi)收藍色(se)波(bo)長和紫(zi)外線(xian)，而且老化時會不(bu)斷變黃。
圖4
大多數現代化浸油都是人工合成并經過標準化處理，確保不會損壞透鏡或隨著老化而變色。要記住的一點是，浸油有一個最(zui)佳的工作溫度。大多數商用合成油的設計工作溫度為23℃，僅1℃的變化將導致折射率變化0.0004。其他浸油可在不同溫度下獲得最佳性能，但對于大多數用途，顯微鏡設備應在23℃下保持穩定（這對于共聚焦顯微鏡等儀器的維護也很重要）。
使用油浸式物鏡（見圖4）開展熒光顯微鏡觀察時，建議使用特殊的低自體熒光油。很多通用浸油(you)在特定(ding)情況下將會發出熒光。大多(duo)數用于熒(ying)光(guang)顯微鏡的浸油都通(tong)過名稱/代(dai)碼之前或之后加上字母“F"來識別。
從使用低倍物鏡查看樣本開始，在切片上找到感興趣的區域。
逐步切換至40倍放大率并將顯微鏡設置科勒照明。
通過物鏡轉盤（物鏡的連接底座）在40x和100x物鏡之間切換但不要直接接觸高倍物鏡。
從顯微鏡的一側看去，小心地將1滴浸油直接滴到蓋玻片上。將高倍物鏡擺入到位（繼續從一側觀察載物臺），先粗調然后微調對焦，讓物鏡前透鏡與浸油發生接觸。有些油浸物鏡的前透鏡是凹面的，這意味著還應該在物鏡上滴一滴油以防止氣泡被困在凹透鏡中。
然后可以再次通過目鏡觀察。僅使用微調對焦來調整視野。雖然高倍物鏡含有彈簧加載式轉換器，但在這個階段粗聚焦很容易導致蓋玻片或載玻片破裂，也可能損壞物鏡前透鏡。
即便您計劃觀察其他載玻片，也應在此階段清除物鏡上的浸油以防止可能污染顯微鏡的其他部分。對于不適合浸沒的顯微鏡部件和物鏡，浸油會滲透并造成損壞。用鏡片清潔紙巾在鏡片上擦一次，去除多余的油。每次擦拭都要用干凈的紙巾擦拭物鏡前透鏡，直到沒有殘留油的痕跡。可使用市售除油溶液或少量二甲苯最終清潔透鏡。同樣，在對透鏡應用任何溶液之前，請務必仔細了解物鏡制造商的建議。
在研究級顯(xian)微(wei)鏡（通常是共(gong)聚焦(jiao)顯(xian)微(wei)鏡）上(shang)有一種不太(tai)常見的(de)浸沒(mei)式物鏡是“水浸"物鏡，通常(chang)在(zai)物鏡筒上(shang)縮寫為“WI"或(huo)“W"。當對細胞培養基中的活細胞成像時，強(qiang)烈建(jian)議使用水(shui)(shui)(shui)浸式物(wu)鏡。有(you)兩種類型的水(shui)(shui)(shui)浸式物(wu)鏡（見圖5）-“水(shui)(shui)(shui)浸"和“水(shui)(shui)(shui)澆蘸"（物(wu)鏡筒上通常縮寫為“WD"，不要與“工作距離"混(hun)淆(xiao)）。
圖5
水(shui)浸式物鏡通(tong)常(chang)與(yu)正置顯微鏡配置一起使(shi)用(yong)，用(yong)于直接浸入水(shui)或水(shui)基介質/緩沖液中。水澆蘸物鏡(jing)則(ze)可提供很長的工作距離。這(zhe)種物鏡(jing)在生產時(shi)還配有(you)十(shi)分(fen)曲折的彎角轉盤(pan)，使(shi)用惰性材料如陶瓷等(deng)制作而成。水浸(jin)物鏡(jing)的使(shi)用方式與(yu)油浸(jin)物鏡(jing)類似，但(dan)要用水代(dai)替油。
使用水(shui)浸(jin)式物鏡(jing)的(de)優點之一是簡單(dan)地將水(shui)作(zuo)為浸(jin)沒介(jie)質。很(hen)明顯(xian)，這種介(jie)質很(hen)容(rong)易清(qing)洗(xi)。此(ci)外，您不需(xu)要根據正在進行的成像使用(yong)特定(ding)的浸沒油，也不需(xu)要使用(yong)顯微鏡(jing)和物鏡(jing)制造商(shang)zhiding的(de)(de)浸(jin)沒介(jie)質(zhi)。但使(shi)用(yong)水(shui)(shui)浸(jin)式(shi)物(wu)(wu)鏡(jing)(jing)(jing)時有(you)(you)一(yi)(yi)(yi)些缺點。與(yu)水(shui)(shui)性(xing)物(wu)(wu)鏡(jing)(jing)(jing)相比，油浸(jin)物(wu)(wu)鏡(jing)(jing)(jing)具有(you)(you)更高的(de)(de)分辨率。此(ci)外，由于(yu)水(shui)(shui)的(de)(de)粘度（與(yu)油相比），使(shi)用(yong)水(shui)(shui)浸(jin)式(shi)物(wu)(wu)鏡(jing)(jing)(jing)容易受到振動和小(xiao)空(kong)氣運動的(de)(de)影響。這種問(wen)題可(ke)以(yi)通過確保顯(xian)微(wei)鏡(jing)(jing)(jing)放置(zhi)(zhi)在防(fang)振臺上(shang)來克服。或者(zhe)，更簡單的(de)(de)解決方案是在切(qie)片(pian)上(shang)放置(zhi)(zhi)一(yi)(yi)(yi)個特殊的(de)(de)環(huan)來形成一(yi)(yi)(yi)個小(xiao)水(shui)(shui)池。水(shui)(shui)浸(jin)式(shi)物(wu)(wu)鏡(jing)(jing)(jing)的(de)(de)最后一(yi)(yi)(yi)個缺點是成本。一(yi)(yi)(yi)些水(shui)(shui)浸(jin)式(shi)物(wu)(wu)鏡(jing)(jing)(jing)的(de)(de)成本相當于(yu)一(yi)(yi)(yi)套完(wan)整的(de)(de)研究(jiu)級顯(xian)微(wei)鏡(jing)(jing)(jing)。
徠卡提供(gong)的(de)水浸(jin)顯(xian)微鏡自動加(jia)水裝置克服了長時間活(huo)細胞成像(xiang)或(huo)篩查(cha)實驗(yan)中出現水蒸(zheng)發的(de)潛在問題(ti)（見圖6）。
圖6：水浸顯微鏡自動加水裝置在實驗運行中自動添加浸沒用水。
活細胞(bao)(bao)通常置于細胞(bao)(bao)間室并且會被細胞(bao)(bao)培養基（或緩沖(chong)液）所覆蓋。間室（和培養基）有助于確保細胞或組織在成像的同時處于穩定的環境內。因此，到小室蓋片的最佳焦距將變得比較大，這使得工作距離較短的油浸式物鏡不適合通過蓋玻片/間室、培養基/緩沖液對細胞/組織成像。
此外，使用油浸式物鏡來觀(guan)察(cha)水性培(pei)養(yang)基內的(de)細胞時(shi)還會(hui)增加額(e)外的(de)折射問題(ti)，因為油和水(shui)的折射率不(bu)同。
觀(guan)察間(jian)室內的(de)(de)(de)活細胞時，光(guang)路將(jiang)(jiang)遇到不同(tong)的(de)(de)(de)折(zhe)(zhe)射率。間(jian)室/蓋玻片的(de)(de)(de)材料和覆蓋細胞或(huo)組織(zhi)的(de)(de)(de)水(shui)性(xing)培養基之(zhi)間(jian)存在不同(tong)的(de)(de)(de)折(zhe)(zhe)射率。從標(biao)本圖像中傳(chuan)出的(de)(de)(de)光(guang)將(jiang)(jiang)在每(mei)個(ge)階段發生折(zhe)(zhe)射而導致球面像差。
圖7：可(ke)以調節(jie)物鏡的(de)校正環(huan)以適配不(bu)同厚度(du)的(de)蓋玻片。電(dian)動校正環(huan)可(ke)優(you)化(hua)設置，把干擾降低(di)到(dao)最小。
最后，水浸(jin)式(shi)物鏡最(zui)為適(shi)合(he)的(de)應(ying)用之一是活細(xi)胞(bao)的(de)共(gong)聚焦(jiao)成像，因此水浸(jin)式(shi)物鏡通常是許多共(gong)焦(jiao)系統(tong)的(de)標配。由于水(shui)與(yu)油相比(bi)粘度較(jiao)(jiao)低(di)(di)，使用(yong)這(zhe)些(xie)物鏡可降低(di)(di)對蓋玻片的(de)表面張力，這(zhe)意味著標本(ben)發生移位的(de)可能性較(jiao)(jiao)小，尤其是(shi)在采集(ji)Z軸(zhou)疊(die)加(jia)的(de)過程中。
圖8：對于使用折射率接近于甘油/水混合物的封片劑（如VECTASHIELD® Hard+SetTM）樣本，甘油物鏡是較佳選擇。
甘油(you)是另一種浸沒介質(zhi)。很多固定(ding)樣本都使用Mowiol、Vectashield或類似的(de)甘(gan)(gan)油(you)基(ji)封(feng)片(pian)(pian)劑封(feng)片(pian)(pian)（見表(biao)1）。這些介質(zhi)的(de)折(zhe)射(she)率接近于80/20 甘(gan)(gan)油(you)/水混(hun)合溶液(ye)的(de)折(zhe)射(she)率（RI=1.45）。對于此類封(feng)片(pian)(pian)劑封(feng)片(pian)(pian)標本，甘(gan)(gan)油(you)物(wu)鏡（見圖8）是zuijia選擇。
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